Struktur-basierte Identifizierung niedermolekularer Wirkstoff zur Inhibition von "Seeding"-Aktivität in Alzheimer Proben unter Verwendung eines Fluoreszenzpolarisation-basierten Assays

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, neurodegenerative disorder that results in an irreversible impairment of cognitive functions due to a severe loss of neuronal cells. Characteristic hallmarks of AD are extracellular deposits of the amyloid-β peptide (Aβ) as plaques in affected patient brains and neurofibrillary tangles of tau protein within the cells. The number of affected patients is estimated to reach ~130 million in 2050 worldwide, making AD a major healthcare burden and one of the biggest challenges of the 21st century. However, even after decades of intensive research, the underlying molecular processes of this complex neurodegenerative disease have not been entirely elucidated and despite numerous drug trial studies, no causative treatment is available up to now. Especially the aggregation of soluble Aβ peptides into stable, β-sheet-rich amyloid fibrils that in the end deposit as plaques in AD patient brains is a presumed culprit of Alzheimer's. Several lines of experimental evidence indicate that so called 'seeds' of the Aβ peptide – small aggregate assemblies that can initiate an avalanche of Aβ aggregation – play a critical role in AD pathogenesis and contribute to the spreading of proteinaceous aggregates throughout the whole brain. Thus, a highly specific and sensitive in vitro method that facilitates the detection of Aβ seeds is crucial to understand the molecular principles of AD and potentially even to monitor disease progression. Here, the establishment of a cell-free aggregation assay for the 42-amino acid long amyloid-β (Aβ42) polypeptide is presented named FAMAβ42/Aβ42 co-polymerization assay or short Aβ42-FP assay as the readout is based on the principle of fluorescence polarization (FP). Briefly, the assay detects the co- assembly of a fluorophore-labeled monomeric tracer (FAMAβ42) with unlabeled peptide over time. As the relative molecular mass of the formed assemblies increases in the course of aggregation, the tracer mobility is reduced which results in a time-dependent increase of its FP signal. As a result, the assay enables to monitor the aggregation process of the Aβ peptide in a time-resolved manner and further facilitates the detection of seeding-competent Aβ species in complex biosamples. I also established a procedure for the enrichment of Aβ aggregate species from biological samples via immunoprecipitations and the subsequent amplification of seeds in Aβ42-FP assays. With this method, Aβ seeds in mouse brain homogenates of three different transgenic models and in human biosamples are detected. Furthermore, a direct correlation between Aβ seeding activity and metabolic impairment in cell models could be shown, substantiating the importance of nucleated Aβ aggregation in AD. Importantly, the FAMAβ42/Aβ42 co-polymerization assay can additionally be applied to screen for small molecules that interfere with the self-assembly of Aβ42 peptides. Furthermore, the assay allows not only high-throughput screening of whole compound libraries for potential Aβ42 aggregation modulators, but also facilitates the elucidation of structure-activity relationships. Until now medicinal chemistry optimization of compounds in terms of their structural features critical for improved potency and pharmaceutical viability remained a challenge with state-of-the-art dye-binding aggregation assays. In this regard, the established FP-based assay represents an improvement as it allows the detection of compound effects without high concentration of binding dyes that might compete with the tested compounds in the Aβ42 reactions. Systematic structure-activity investigations with derivatives of the known amyloid binder K114 allowed me to determine distinct substructural elements that empower a small molecule to delay the Aβ42 aggregation process, exemplarily shown with the hit compound LT1. LT1 potently reduces both spontaneous and seed-mediated Aβ42 aggregation at substoichiometric concentrations. Mechanistic studies demonstrate that LT1 targets small, on-pathway, seeding-competent Aβ42 assemblies and delays their extension into larger fibrillar structures. The intrinsic fluorescence of compound LT1 is further exploited to monitor Aβ42 fibril assembly. Finally, I could show that treatment with LT1 efficiently decreases seed-mediated nucleation of Aβ-fibrils prepared from brains of AD transgenic mice, indicating that it targets and influences the activity of disease-relevant Aβ aggregate species. The established Aβ42-FP technology is a fast, efficient and powerful tool with many potential applications in the drug discovery field as well as in basic and applied research.Die Alzheimer Krankheit ist eine irreversible neurodegenerative Erkrankung, bei der Betroffene aufgrund eines fortschreitenden Absterbens von Nervenzellen im Gehirn unter einer sukzessiven Abnahme ihrer kognitiven Leistungsfähigkeit leiden. Charakteristische Merkmale der Erkrankung sind extrazelluläre Ablagerungen des Amyloid-β (Aβ) Peptids als Plaques im Gehirn und intrazelluläre Neurofibrillenbündel, die aus dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau bestehen. Es wird angenommen, dass die Zahl der Betroffenen bis 2050 auf ca. 130 Millionen ansteigen wird, was Alzheimer zu einer immensen Belastung für das Gesundheitssystem und einer der großen Herausforderungen des 21. Jahrhunderts macht. Doch trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung gibt es bisher noch keine wirksame Behandlung und auch der zugrunde liegende molekulare Prozess konnte noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Besonders die Aggregation von löslichen Aβ Peptiden zu stabilen Amyloid-Fibrillen, die sich als Plaques im Gehirn von Alzheimer Patienten ablagern, scheint maßgeblich zur Erkrankung beizutragen. Verschiedene Studien deuten mittlerweile darauf hin, dass sogenannte „seeds“ des Aβ Peptids, kleine Aggregatspezies, die die Kaskadevon Aggregation und Ablagerung anstoßen können, eine entscheidende Rolle bei der Krankheitsentstehung und der Ausbreitung von Aggregaten im Gehirn spielen. Daher sind spezifische und sensitive in vitro Methoden essentiell, mit denen Aβ „seeds“ detektiert werden können. Nur wenn das gelingt, können die zugrundliegenden molekularen Prozesse überhaupt erst richtig verstanden und der Krankheitsverlauf auf molekularer Ebene verfolgt werden. In dieser Arbeit wird die Etablierung eines auf Fluoreszenzpolarisation (FP)-basierten Assays gezeigt, mit dem die Aggregation des Aβ42 Peptids zeitaufgelöst verfolgt werden kann, der Aβ42-FP Assay. Dabei fungiert ein fluorophor-markiertes Aβ42 Monomer als Tracer (FAMAβ42), der im Verlauf der Aggregation mit unmarkierten Peptiden co-aggregiert, weswegen auch die Bezeichnung FAMAβ42/Aβ42 Co-Polymerisation Assay verwendet wird. Kurz zusammengefasst bewirkt die während der Aggregation auftretende Erhöhung der Molekülmasse eine Verringerung der Tracer Mobilität, die zu einer zeitaufgelösten Zunahme des Polarisationssignals führt. Neben der spontanen Aggregation von Aβ42 detektiert der Aβ42-FP Assay auch seeding-kompetente Strukturen in komplexen biologischen Proben, da die Aggregationsgeschwindigkeit aufgrund ihrer Anwesenheit beschleunigt ist. Dafür werden Aβ Aggregate zunächst mittels Immunopräzipitation isoliert und anschließend im Fluoreszenzpolarisations-Assay amplifiziert. Mit dieser Methode konnten seeding-kompetente Strukturen in Gehirnproben von drei verschiedenen transgenen Mausmodellen und in humanen Proben nachgewiesen werden. Weiterhin konnte eine direkte Korrelation zwischen Seeding-Aktivität und einer Beeinträchtigung des Zellstoffwechsels in einem Zellmodell gezeigt werden, was die Bedeutung der durch „seeds“ verstärkten Aggregation für den Krankheitsprozess unterstreicht. Weiterhin von Bedeutung ist, dass der Aβ42-FP Assay auch für eine Anwendung im Bereich der Wirkstofffindung geeignet ist, da damit Moleküle identifiziert werden können, die in den Selbstassemblierungsprozess des Aβ42 Peptids eingreifen. So können mit dem Assay nicht nur ganze Wirkstoffbibliotheken im Hochdurchsatzverfahren nach potentiellen Aggregationsmodulatoren durchleuchtet, sondern auch deren Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufgeklärt werden. Mit dem bisherigen Stand der Technik erwies sich die medizinisch-chemische Optimierung von Wirkstoffen hinsichtlich einzelner struktureller Komponenten für eine verbesserte Wirksam- und Verfügbarkeit als Herausforderung. Da man hierfür auf hohe Konzentration eines Reporterfarbstoffs angewiesen war und demnach kompetitive Bindungen zwischen Reportermolekülen und Wirkstoffen nicht ausgeschlossen werden konnten, stellt der neu etablierten Aβ42-FP Assay in dieser Hinsicht eine deutliche Verbesserung dar. Systematische Struktur-Wirkungs-Analysen mit dem bekannten Amyloid-Farbstoff K114 und neu synthetisierten Derivaten ermöglichte es mir einzelne strukturelle Elemente zu identifizieren, die entscheidend dazu beitragen die Aβ42 Aggregation zu verlangsamen. Der Wirkstoff LT1 stellte sich hierbei als wirksamste Verbindung heraus. Der Substanz gelang es auch bei sub-stöchiometrischen Konzentrationen sowohl die spontane, als auch die durch „seeds“ beschleunigte Aggregation zu verzögern. In mechanistischen Analysen konnte weiterhin gezeigt werden, dass LT1, kleinere, „seeding“-kompetente Aggregate angreift und deren Elongation zu größeren Fibrillen verlangsamt. Die intrinsische Autofluoreszenz der Verbindung LT1 wurde ebenfalls genutzt, um damit die Aggregation von Aβ42 Peptiden zeitaufgelöst zu verfolgen. Abschließend wurde gezeigt, dass LT1 auch ich der Lage ist die Aβ42 Aggregation zu verlangsamen, wenn sie durch krankheitsrelevante „seeds“ stimuliert wurde, die aus transgenen Alzheimer Mausgehirnen isoliert wurden. Der etablierte fluoreszenzbasierte Aβ42-Aggregationsassay stellt in jedem Fall eine neuartige und effiziente Methode dar, die aufgrund ihrer Leistungsfähigkeit für viele Anwendungen im Bereich der Wirkstofffindung und der molekularen Forschung geeignet ist